14 MĚSÍCŮ PROVOZU SEPARÁTORU AMICUS BAXTER

V práci je shrnuta zkušenost s provozem separátoru Amicus Baxter, určeného k odběru přípravku trombocyty z aferézy deleukotizované (TAD). Přístroj odebírá trombocyty leukoredukčním systémem, produkt je zbavený leukocytů jiným způsobem než použitím filtru.
V období od 10.1.2000 do 28.2.2001 jsme 198 separacemi připravili 385 kusů přípravků TA (trombocyty z aferézy). Průměrně jsme během jedné separace odebrali 1.9 (TU) transfuzních jednotek přípravku. Jednalo se většinou o přípravky obsahující 300 nebo 200 miliard trombocytů. Jsou hodnoceny výsledky sběrů tohoto vysoce účinného separátoru. V práci se zaměřuji na výsledky výtěžnosti trombocytů a kontaminaci leukocyty.
Jsou uváděny příklady možností nastavení parametrů separací (vstupní hodnoty dárce, plánovaný výtěžek a z těchto hodnot vyplývající dobu separace , množství zpracované krve a objem použitého antikoagulačního roztoku). Příznivý prvek v programovém vybavení separátoru je možnost zohlednit střední objem trombocytů dárce ve vztahu k minimálnímu množství plazmy zajišťující pětidenní exspiraci přípravku. Tato skutečnost má příznivé dopady při výrobě trombocytů z aferézy od dárců s nízkým titrem izoaglutininů. Tyto přípravky je možné považovat za universální . Činnost separátoru Amicus je hodnocena z hlediska konfortability pro dárce a z hlediska obsluhujícího personálu. Práce shrnuje výhody i úskalí.
V poslední části práce je hodnocena zkušenost s řešením poruch separátoru a spolupráce s firmou, zajišťující servis přístroje.

Výskyt mutace 5,10-metylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR C677T) u mladých pacientů s tromboembolickou nemocí

Východisko:
Mírná hyperhomocysteinémie (Hcy) je rizikový faktor pro žilní trombózu a je výsledkem kombinací vrozených faktorů a vnějších vlivů. Nejčastější genetickou variantou, která může způsobit Hcy je termolabilní mutace enzymu 5,10-metylentetrahydrofolátreduktázy (MTHFR C677T). Prevalence heterozygotní varianty MTHFR C677T u nemocných s žilním tromboembolismem (TEN) je mezi 35-45%, u homozygotní formy v 10-25% v evropské populaci.
Metody a soubor nemocných:
Stanovili jsme frekvenci MTHFR C677T metodou PCR v souboru 107 nemocných ze 107 nepříbuzenských rodin s první epizodou TEN do 50 ti let věku. Zároveň byly vyšetřeny i ostatní vrozené trombofilní faktory (FV Leiden, mutace FII 20210 G-A, protein C, protein S, antitrombin). Výsledky ukazuje následující tabulka.

muži/ženy	47	59
průměrný věk (roky )	40 (20-87)
průměrný věk 1.ataky TEN ( r.)	32
MTHFR	28	27
spontánní příhody	15	6
riziková situace	13	21
heterozygoti/homozygoti	42/13

Závěry:
Ověřili jsme v našem souboru vysokou prevalenci MTHFR C677T u mladých pacientů s tromboembolickou nemocí. Naše výsledky jsou kompatibilní se závěry podobných studií v evropské populaci. MTHFR se neukazuje jako samostatný rizikový faktor pro vznik TEN. Naše výsledky budeme doplňovat o vyšetření homocysteinu na lačno a hladinu folátů k upřesnění rizika pro rekurenci TEN u těchto nemocných.

VLIV ANTIOXIDANTŮ NA PŮSOBENÍ DESTIČKOVÝCH AKTIVÁTORŮ

Z literárních dat je známo, že vitamin E snižuje adhezi a agregaci lidských krevních destiček in vivo. Hlavním cílem naší práce bylo zjistit, zda inkubace promytých krevních destiček s Troloxem a resveratrolem ovlivní agregaci destiček aktivovaných kolagenem, ADP a peptidem aktivujícím trombinový receptor (TRAP). Trolox, který je stabilním derivátem vitaminu E, je látka používaná ke kalibraci metod pro stanovení celkové antioxidační kapacity krevní plazmy. Resveratrol je fytoalexin přítomný v červeném víně i v ovocných šťávách, který díky své antioxidační kapacitě snižuje riziko atherosklerózy.
Využitím metod pro stanovení antioxidační kapacity jsme zjistili, že resveratrol má antioxidační schopnost srovnatelnou s Troloxem. Trolox (1-4 mM) nebo resveratrol (5-300 mM) byly 30 minut inkubovány s 2x promytými destičkami. Agregace byla měřena optickou metodou podle Borna (Chronolog, Havertown, USA). Jako další parametr destičkových funkcí byl pomocí HPLC na reverzní fázi stanoven uvolněný serotonin. Malondialdehyd, produkt lipoperoxidace, byl rovněž analyzován s využitím HPLC na reverzní fázi. Při aktivaci kolagenem docházelo k inhibici agregace promytých destiček za přítomnosti Troloxu nebo resveratrolu v závislosti na koncentraci přidaného antioxidantu. Také množství vzniklého MDA a uvolněného serotoninu bylo sníženo přítomností antioxidantů. Při použití ADP jako aktivátoru byly zjištěny podobné výsledky v případě resveratrolu, Trolox vykazoval slabší účinek. V případě TRAPu jako silného induktoru inhibovaly agregaci pouze vysoké koncentrace resveratrolu a Trolox byl neúčinný. Resveratrol ve srovnání s Troloxem inhibuje agregaci destiček v řádově nižších koncentracích. Naměřená data lze využít pro další studium vlivu antioxidantů na destičkové funkce.

Poděkování: Tato práce vznikla díky grantu IGA MZd ČR NK-6841.

Je ProCŇ Global ovlivněn krevní skupinou ABO systému?

Žilní trombózy a plicní embolie (TEN) patří k nejčastějším komplikacím ve všech lékařských oborech. Výrazně zvyšují mortalitu, často i morbiditu celé řady dalších chorob.

Test, který by nás upozornil na riziko těchto komplikací by umožnil důslednější prevenci TEN. Test ProCŇ Global byl navržen jako funkční globální screeningový test pro stanovení antikoagulační kapacity systému proteinu C (PC) a doporučen k použití k diagnostice vrozených i získaných poruch v systému proteinu C. Předpokladem pro správný výsledek je hodnota aPTT ve fyziologickém rozmezí.

V r. 1969 Jick a kol. prezentovali data o nižším výskytu krevní skupiny 0 ve skupině osob s trombózou v porovnání se zdravou populací. Toto pozorování bylo v následujících letech opakovaně potvrzeno. Příčina nižšího výskytu trombózy u jedinců s krevní skupinou 0 není zcela jasná, zatím se tato skutečnost dává do souvislosti s nižší hladinou FVIII. Zůstává otázkou, zda je to jedinou příčinou nebo je AB0/H systém nezávislým rizikovým faktorem trombózy.

Zajímalo nás, zda se průměrné hodnoty PCG liší dle krevní skupiny.
V grafu je závislost PCG na FVIII u osob FV Leiden negativních.






V tab. jsou uvedený průměrné hodnoty PCG-NR pro krevní skupiny (vzhledem k malým číslům použito pouze dělení na skupiny ne-0 a 0) rozdělené dle nálezu Leidenské mutace FV a přítomnosti či nepřítomnosti trombózy v OA. Ve všech skupinách našeho souboru byly průměrné hodnoty u osob s KS 0 vyšší než průměr u ne-0.

Důvod pro tento rozdíl neznáme. Předpokládáme, že se může jednat o vliv vyšší hladiny faktoru VIII, která snižuje hodnotu NR. Nezdá se však, že to bude jediný důvod. Tab.Výsledky PCG u osob s trombózou a bez trombózy a FVL

FVL	Trombóza	KS – počet		průměr z PCG		T-test
		ne-0	0	ne-0	0	p =
Negativní	T-	20	9	0,94	1,09	0,865
	T+	127	39	0,87	0,99	0,028
Negativní	Celkem	147	48	0,88	1,01	0,024
Pozitivní	T-	17	4	0,56	0,62	0,229
	T+	36	13	0,55	0,56	0,044
Pozitivní	Celkem	53	17	0,55	0,57	0,014
Celkem	T-	37	13	0,76	0,93	0,914
Celkem	T+	167	52	0,80	0,89	0,256
Celkem		200	65	0,79	0,89	0,321

STANOVENÍ KONCENTRACE D-DIMERŮ V PLASMĚ SROVNÁNÍ TŘÍ METODIK

Stanovení koncentrace DD v plasmě patří k základním diagnostickým testům hyperkoagulačních stavů.
Na OKH FN USA v Brně jsme vyšetřili 60 vzorků plasmy metodou semikvantitativního stanovení DD aglutinací na destičce ( Dimertest Agen Latex Kit ) a kvantitativně jednak na plně automatickém analyzátoru BCS Dade Behring a dále ELISA metodou Ddimer Vidas, která je považována za zlatý standart v laboratorní diagnostice DD. Bylo takto vyšetřeno 20 pacientů s maligním onemocněním ( skupina A), 20 pacientů s akutním infarktem myokardu ( AIM) (skupina B ) a 20 pacientů s objektivně prokázanou venózní tromboembolií (VTE) (skupina C). Pacienti ve skupině A byli navíc rozděleni do dvou podskupin - nemocní s nediseminovanými ( A1) a generalizovanými nádory (A2).

Výsledky :
1. Ve skupině A hladina DD korelovala s rozsahem (generalizací) nádorů.
2. Ve skupině B ( AIM) nebyla detekována zvýšená hladina DD u nekomplikovaných AIM. Zvýšenou koncentraci DD jsme ojediněle zaznamenali u pacientů s komplikacemi ( kardiogenní šok ).
3. Ve skupině C ( VTE) byla ve více jak 90% zachycena zvýšená koncentrace DD alespoň jednou metodikou.
4. Největší dynamiku, reproducibilitu a spolehlivost jsme prokázali u metodiky DD Vidas.

Závěr:
DD ELISA Vidas představuje spolehlivou a rychlou metodiku v běžné klinicko-laboratorní praxi. U pacientů se solidními nádory může navíc dynamické sledování koncentrace DD představovat jednu z možností monitorování regrese neb progrese neoplasie.

MONITOROVÁNÍ LÉČBY HEPARINEM

Monitorování léčby heparinem představuje stále velký problém. Dosud nemáme k dispozici test, který by maximálně odrážel antitrombotické působení heparinu u nemocného. Příčin je mnoho. Jsou to jednak důvody ze strany polyvalentního působení heparinu, jednak ze strany testování samotného. Heparin patří mezi nepřímá antikoagulancia, tj. ke svému účinku potřebuje především antitrombin III (AT). V systémech hemostázy nepůsobí pouze inhibici aktivovaných koagulačních faktorů, především IIa a Xa, ale ovlivňuje také primární hemostázu, endotel, fibrinolýzu. Zejména vazba na endotel je důležitá při zahájení léčby nefrakcionovaným heparinem (UFH), protože určité množství heparinu je nezbytné k saturaci endotelu. Heparin se také váže na nejrůznější látky, které spolupůsobí v systémech hemostázy. Důležitá je schopnost heparinu vázat se na granulocyty, lymfocyty a makrofágy, která je zřejmě nutná např. pro jeho protizánětlivé působení (nezávislé na AT). Obecně je heparin schopen se vázat s nejrůznějšími makromolekulami v organismu - lipoproteiny, enzymy, léky - a tím modifikovat svůj antitrombotický účinek.Vazbu heparinu na AT a tím jeho antitrombotické působení umožňuje specifická pentasacharidová sekvence. Tento pentasacharid je však přítomen pouze asi u jedné třetiny heparinových molekul. Zbytek není antitrombotického působení schopen. Různá koncentrace proteinů neutralizujících heparin a dalších látek vysvětluje nejen individuální citlivost na heparin, ale i rozdílnou citlivost organismu na heparin např.za fyziologického stavu, v případě zánětu, nádorového onemocnění, trombózy, po velkém chirurgickém zákroku, ale také v těhotenství.)
V současné době se ke sledování podávání heparinu používají dva hlavní typy testů: aktivovaný parciální tromboplastinový test (aPTT) a měření aktivity proti faktoru Xa (anti-Xa), popřípadě anti IIa aktivity. Trombinový čas lze vzhledem k vysoké citlivost k heparinu použít k monitorování heparinizace pouze v modifikované podobě. Těmito testy měříme rozdílné vlastnosti nebo lépe působení heparinu, ale žádný nezobrazuje jeho přímý léčebný efekt.
APTT se používá k monitorování léčby UFH, pro monitorování léčby LMWH není vhodné z důvodu minimálního prodloužení (k nastavení správné dávky se používá stanovení antiXa). Jeden z nejdůležitějších předpokladů použití aPTT je citlivost používaného parciálního tromboplastinu na heparin s dostatečným terapeutickým rozmezím. Toto rozmezí by si měla každá laboratoř stanovit vlastní. U citlivých aPTT reagencií je terapeutické rozmezí až 2-5 násobek normální hodnoty. Vždy by měla být známa výchozí hodnota aPTT. Test nelze použít při prodloužení aPTT jiné etiologie (defekt faktoru XII, lupus antikoagulans). Lze říci, že aPTT nad minimální limit je většinou sdruženo s ochranou proti trombóze, avšak aPTT v léčebném rozsahu nezaručuje ochranu nemocného před krvácivými projevy.
Při preventivním podávání heparinu (UFH i nízkomolekulárního - LMWH) v běžném provozu není třeba koagulačního sledování. APTT se většinou nemění (heparin o nižší molekulové hmotnosti ovlivňuje aPTT minimálně). Pokud je přesto laboratorní vyšetření požadováno, většinou se používá vyšetření anti Xa aktivity (ev. její modifikace). Jak aktivita anti IIa, tak anti Xa jsou v podstatě pouze funkcí koncentrace heparinu. I když se dají stanovit u všech typů heparinů, používá se především u LMWH. Anti-Xa indikuje počet vazebných míst pro AT u heparinu, anti-IIa měří subfrakce větších molekul heparinu (nad 18 sacharidů). Bylo však zjištěno, že anti Xa aktivita není přímo úměrná účinku heparinu ani ev. krvácivým projevům.
Malá pozornost se věnuje správnému odběru krve, který může výsledek laboratorního vyšetření výrazně ovlivnit. Při testování heparinu se jedná zejména o nebezpečí aktivace krevních destiček a tím uvolnění destičkového faktoru 4 (PF4), který heparin neutralizuje a tím snižuje jeho hladinu v testovaném vzorku. Doporučuje se proto používat speciální odběrové zkumavky, zajistit rychlý transport vzorku do laboratoře a provedení analýzy do 2 hodin po odběru.
Pro řádnou interpretaci výsledků je důležitá doba odběru vzorku pro vyšetření. Při preventivním i léčebném podávání LMWH je doporučován odběr 3-4 hod po injekci, pro UFH aplikovaným v bolusech 1 hod před další injekcí , při kontinuálním podávání kdykoliv. Pokud se pro testování rozhodneme, je nutná vzhledem k použití heparinu i v akutní medicíně statimová dostupnost vyšetření. To lze zajistit vzhledem k nízké frekvenci vyšetření pouze použitím setů s vysokou stabilitou reagencií. Pro nízce frekventované vyšetření je z ekonomického hlediska obtížnější zajistit správnost a reprodukovatelnost výsledků. Předpokladem je správné provedení kalibrace pomocí firemních kalibračních materiálů a vyšetření atestovaných kontrol správnosti, testovaných s každou sérií vyšetření.
nterpretace výsledku musí být prováděna klinikem individuálně v závislosti na typu použitého preparátu.
V naší práci prezentujeme naše zkušenosti s diagnostickým setem COAMATIC HEPARIN f. Chromogenix, který plně vyhovuje podmínkám naší koagulační laboratoře a frekvenci vyšetření anti Xa v naší nemocnici.

SLEDOVANIE DYNAMIKY VYBRANÝCH UKAZOVATELOV PROKOAGULACIE/ FIBRINOLÝZY U PACIENTOV S NESTABILNOU ANGÍNOU PECTORIS.

Nestabilná angína pectoris je klinický syndróm, pri ktorom je najdôležitejším patogenetickým mechanizmom nástenný doštičkový trombus, ktorý nasadá na porušený, ulcerovaný alebo erodovaný aterosklerotický plat, ho vedie k čiastočnému koronárnemu uzáveru.
Z patofyziologického hľadiska u 2/3 pacientov s nestabilnou angínou pectoris ide o ruptúru mäkkého, vulnerabelného platu s rôznym stupňom nasadajúcej trombózy a s rôznym stupňom aktivácie prokoagularných/fibrinolytických mechanizmov a koronárnej vazokonstrikcie. V súbore 15 pacientov, hospitalizovaných na koronárnej jednotke s nestabilnou angínou pectoris/ <48h od začiatku kľudových stenokardií/, autori sledovali dynamiku niektorých vybraných ukazovateľov prokoagulácie/ fibrinolýzy ( agregabilita trombocytov, TF, F VII, F VIII, vWf, PAI-1, tPA, beta-tromboglobulin, PC, PS, trombomodulin/ v deň prijatia a 4.deň hospitalizácie/ pri liečbe nízkomolekulovými heparínmi/.

PROPYLGALÁT - NOVÁ SUBSTANCE K MONITOROVÁNÍ ANTIAGREGAČNÍ LÉČBY

Inhibice funkce krevních destiček působením ASA je zprostředkována cestou blokace funkce cyklooxygenázy - enzymu nezbytného k tvorbě prostaglandinů. Monitorování antiagregační léčby pomocí acetylsalicylové kyseliny (ASA) nebylo do současné doby dobře proveditelné. Sledování léčby pomocí kolagenové křivky, případně křivky získané za použití adenosindifosfátu (ADP) neposkytuje srovnatelné a interpretovatelné výsledky. Navíc zjištěné hodnoty mohou být ovlivněny přítomností heparinu.
Nová metoda ke sledování antiagregační léčby pomocí ASA využívá k vyvolání agregační odpovědi kationtové substance propylgalátu (Cationic Propyl Gallate - CPG). Stanovení probíhá v optickém agregometru za použití destičkami bohaté (PRP) a chudé (PPP) plasmy. Měří se jednak velikost maximální amplitudy a dále rychlost náběhu agregační křivky (slope). Změří se agregační odpověď před podáním protidestičkové terapie (ASA) a pak se provádí pravidelná měření v průběhu terapie, dokud se nedosáhne optimálního snížení hodnoty slope. Kontroly po dosažení této hodnoty je potom možné provádět v delších časových intervalech. Heparin do hodnoty 4,0 IU/ml nemá vliv na výsledek vyšetření. Počty destiček pod 100 . 109/l mohou významně ovlivnit výsledek testu. Nelze stanovit vzorky s chylózní, ikterickou a hemolytickou plazmou.
Krev byla odebíráná v poměru 9 : 1 do nádobky s 0,109 mol/l citrátem sodným za standardních podmínek. Před odběrem bylo vyšetřovaným doporučeno nekouřit a nepít alkoholické nápoje. Obě plazmy se připravují technikami používanými pro optické agregometry a stanoví se v nich počet krevních destiček. Počet destiček v PRP byl upraven na 300 . 109/l. Vlastní stanovení agregační odpovědi byla prováděna v optickém agregometru PAP 4. Přístroj byl nastaven na hodnoty minimální (PPP) a maximální (PRP) absorbance. Po přidání propylgalátu dochází k vytvoření agregační křivky. V naší studii jsme použili soubor zdravých lidí. Skupina byla interně vyšetřena, byla zjišťována případná terapie antiagregačními léky a léky ovlivňujícími funkci krevních destiček minimálně do 10 dnů před odběrem. Jedincům kontrolní skupiny byla podána ASA v těchto intervalech (0. den - 100 mg, 1. den - 200 mg, 2. den 400 mg) a současně byla provedeno agregační vyšetření s propylgalátem před podáním ASA, 1. den, 2. den a 3. den.
Do skupiny nemocných byly zařazeni pacienti II. interní kliniky FN Hradec Králové s prodělaným akutním infarktem myokardu, léčení klasicky pomocí ASA a nitrátů. Většina z nich měla souběžnou léčbu betablokátory. Všichni byli antikoagulačně léčeni buď nefrakcionovanými nebo nízkomolekulárními hepariny. V průběhu akutní fáze byla řada z nich léčena přímou PTCA nebo tromboembolicky.
První výsledky této studie ukazují, že agregace za použití CPG by bylo možné využít ke sledování terapie antiagregačními působky na bázi ASA.

PRVNÍ ZKUŠENOSTI S VYUŽITÍM KATIONICKÉHO PROPYLGALLÁTU JAKO INDUKTORU AGREGACE TROMBOCYTŮ V HODNOCENÍ ÚČINNOSTI ANTIAGREGAČNÍ TERAPIE

Úvod:
V poslední době se v literatuře množí údaje o případech s nedostatečným antiagregačním efektem ASA; někteří autoři hovoří dokonce až o 30% tzv. non responderů. Doposud se ke sledování účinnosti terapie ASA užívalo zejména vyšetření agregability trombocytů ex vivo za použití běžných agregačních induktorů (ADP, kolagen, adrenalin, kyselina arachidonová, atp.). Tyto metodiky se však vyznačují nízkou senzitivitou, specifitou i reprodukovatelností. Zcela novou metodou, která slouží k monitorování účinnosti léčby ASA je měření agregace trombocytů ex vivo po indukci kationtickým propylgallátem (CPG). V několika málo publikacích byla u této metody popsána 100% senzitivita v detekci poruchy agregability způsobené ASA.
Cílem naší práce bylo:
1) posouzení efektu různých dávek ASA (100 mg/den, 400 mg/den) na změnu agregační křivky po indukci adrenalinem, ADP, kolagenem a CPG;
2) stanovení cut-off hodnot agregability s výše uvedenými agregačními induktory po terapii různými dávkami ASA.
3)srovnání senzitivity jednotlivých agregačních induktorů. Metodika:
Bylo vyšetřeno 27 zdravých dobrovolníků průměrného věku 33,6 let, kteří v posledních 14 dnech neužívali ASA ani jiné léky ovlivňující agregabilitu destiček. U 17 vyšetřovaných jsme sledovali agregabilitu trombocytů po indukci ADP, kolagenem, CPG a epinefrinem před a 24 hodin po ingesci 400 mg ASA. U 10 probandů byla sledována agregabilita před a 3 dny po podání 100 mg ASA. Pro analýzu agregační odpovědi po indukci byla použita citrátová plasma, odběr krevního vzorku byl proveden za standardních podmínek z nezatažené paže.
Agregace destiček byla stanovována pomocí Bornovy turbidimetrické metody (agregometr APACT II) po přidání induktorů agregace (10 umol/l ADP, 110 mg/ml kolagenu, 550 umol/l epinefrinu, a 300 umol/l CPG).
Z agregační křivky jsme hodnotili- % agregace, slope (% agregace za minutu), délku lag fáze při použití kolagenu a T 50 (čas potřebný k dosažení 50 % celkově dosažené agregace) u CPG.
Výsledky a diskuse:
Měřením agregační odpovědi po jednorázové ingesci 400mg ASA bylo u skupiny 17 probandů zjištěno, že většina výsledků stejné metody před a po ingesci nekoreluje, což lze interpretovat jako nízkou stabilitu použitých metodik. Významné souvislosti jsme nalezli pouze u CPG (kk 0,55). K statisticky signifikantním změnám agregace po terapii přitom došlo u většiny induktorů; nejvýznamnější změny byly nalezeny u T50CPG (p=0,0000002) a CPGSlope (p=0.00000002). Z těchto důvodů považujeme tyto parametry za nejpřínosnější pro monitorování účinnosti terapie denní dávkou 400 mg ASA. Při určení cut-off hodnot pro jednorázovou ingesci 400 mg ASA jsme zjistili, že mezní hodnoty lze spolehlivě určit u parametru CPGSlope (<53%/min)a T50CPG (>91s). U skupiny, která dostávala 3 dny 100 mg ASA nebyly u většiny probandů nalezeny významné souvislosti mezi ukazateli agregace měřenými před a po ingesci ASA. U této skupiny probandů došlo po terapii pouze k významné změně u CPGSlope (p=0,0003). Z těchto důvodů považujeme tento parametr za nejpřínosnější pro monitorování účinnosti terapie denní dávkou 100 mg ASA. Při určení cut-off hodnot pro opakovanou ingesci 100 mg ASA jsme zjistili, že mezní hodnoty lze spolehlivě určit u parametru CPGSlope (<55%/min).
V naší studii jsme při použití induktoru CPG zjistili významnou změnu hodnot Slope i T50 u téměř všech sledovaných; u stejných osob jsme přitom nalezli vysoké procento falešně negativních výsledků při použití jiných agregačních induktorů - 30% u ADP při dávce 100 i 400 mg/d ASA, 75% u kolagenu při dávce 100mg/d ASA. Pouze u jedné osoby z celého souboru (ingesce 100 mg ASA) jsme nenalezli významné změny parametrů agregace po indukci CPG - v tomto případě jde nejspíše o non respondera (bylo prokázána také nedostatečná reakce na indukci kolagenem i ADP).
Závěr:
Měření agregace trombocytů po indukci kationtickým propylgallátem je perspektivní metoda s vysokou senzitivitou a dobrou reprodukovatelností pro monitorování terapie různými dávkami ASA.

ÚLOHA VYŠETŘENÍ KINETIKY TROMBOCYTŮ PŘI INDIKACI SPLENEKTOMIE U NEMOCNÝCH S IDIOPATICKOU TROMBOCYTOPENICKOU PURPUROU (ITP)

Východisko:
Idiopatická trombocytopenická purpura (ITP) je autoimunitní onemocnění se zvýšeným zánikem trombocytů s charakteristicky zkráceným poločasem jejich přežívání. Léčbou první volby ITP je kortikoterapie, při jejím neúspěchu by dalším krokem mělo být provedení splenektomie. Interpretace předoperačního vyšetření přežívání trombocytů jako pozitivně prediktivního markeru úspěšnosti splenektomie je stále kontroverzní. V současnosti se vychází z teorie, že pokud je destrukce trombocytů převážně ve slezině, bývá splenektomie úspěšná. Při převažujícím zániku v játrech, je splenektomie úspěšná u 1/3 nemocných. Je známo, že predominanci ve splenické sekvestraci má asi 75% nemocných, s věkem vzrůstá podíl zániku v játrech, u těžkých forem bývá pozorován zánik difúzní.

Metodika:
K vyšetření kinetiky trombocytů se používá dárcovských 51Cr?značených trombocytů připravených z plné krve. Vlastní hodnocení spočívá v měření aktivity vzorků krve nemocného, dále ve vyhodnocení poměru a křivek ze zevních měření nemocného (aktivita nad slezinou a játry).

Výsledky:
V posledních 3 letech podstoupilo toto vyšetření na našem pracovišti 28 nemocných s ITP. Zhodnotili jsme výsledky vyšetření přežívání trombocytů u 13 splenektomovaných pacientů ve vztahu k dosaženému léčebnému efektu. Medián poločasu přežívání trombocytů byl u této skupiny nemocných 6 hodin. Při lokalizaci zániku dárcovských trombocytů převažovala vyrovnaná sekvestrace dárcovských destiček v játrech a ve slezině. Tento výsledek byl zjištěn u 7 (54%) nemocných, u 5 (71,5%) z nich byla splenektomie úspěšná. U 3 (23%) nemocných byl zjištěn zvýšený zánik dárcovských trombocytů ve slezině, u všech těchto nemocných bylo splenektomií dosaženo úplné normalizace hodnot trombocytů bez nutnosti další léčby. U 3 nemocných (23%) nebyla zjištěna zvýšená sekvestrace ve slezině ani v játrech, přesto u 2 nemocných (66,6%) došlo po splenektomii rovněž k normalizaci trombocytů.

Závěr:
Lokalizaci destrukce trombocytů v rámci vyšetření jejich přežívání nelze považovat za spolehlivé vodítko v indikaci provedení splenektomie u nemocných s ITP. Důvodem pro toto tvrzení je skutečnost, že splenektomie byla úspěšná i u 2/3 nemocných, u nichž při tomto vyšetření nebyl prokázán zvýšený zánik trombocytů v játrech ani ve slezině. Jedinou výjimku tvoří situace s převažující sekvestrací dárcovských trombocytů ve slezině, kdy můžeme pokládat efekt splenektomie předem prakticky za jistý.

VYUŽITÍ CYTOREDUKČNÍ ERYTROCYTAFERÉZY V LÉČBĚ POLYGLOBULIE.

Indikací k provedení léčebné cytoredukční erytrocytaferézy jsou patologické stavy, způsobující dlouhodobý vzestup počtu erytrocytů, hemoglobinu a hematokritu. Tento nárůst je označován jako polycytémie primární (polycytemia rubra vera) nebo sekundární. Sekundární polycytémie (polyglobulie) vzniká nejčastěji při poklesu pO2 u vrozených cyanotických srdečních vad s pravolevým zkratem, u chron. obstrukčních nebo difuzních plicních onemocnění, nádorů ledvin, jater, CNS a u renovaskulárních onemocnění. Po transplantaci ledvin je polycytémie popisována ve 20% případů.
Hemodynamické vlastnosti krve jsou ovlivněny cévním průměrem, krevním tlakem, koncentrací bílkovin s velkými molekulami (fibrinogen) a množstvím buněčných elementů v cirkulaci. Při zvýšené hodnotě hematokritu dochází k nárůstu viskozity krve, zvýšení agregability erytrocytů a zpomalení průtoku krve v periferní mikrocirkulaci. Tím dochází ke snížení perfuze důležitých orgánů kyslíkem (ledviny, mozek). Přímé ovlivnění viskozity krve způsobené její hypercelularitou je možné jen snížením počtu erytrocytů a tím i hematokritu při mimotělní hemorheoterapii. Tímto léčebným přístupem je možno dosáhnout normalizace rheologických vlastností krve a snížit riziko tromboembolických komplikací.
Při léčbě polyglobulie je zásadní kauzální léčba základního onemocnění. Ovlivnění vlastní polyglobulie je vždy součástí celkové léčby pacienta.
Cílem léčby primární polycytémie je dosažení normálních hodnot krevního objemu, viskozity krve a počtu trombocytů současně s útlumem hypermetabolismu při myeloproliferaci. Je doporučováno udržovat hodnotu hematokritu v rozsahu 0,24 - 0,49.
U sekundárních polyglobulií je cytoredukční léčba indikována až tehdy, kdy polyglobulie přestává být adaptačním mechanizmem zlepšujícím zásobování tkání kyslíkem a stává se maladaptivní přispíváním ke vzniku plicní hypertenze, dilatace pravé komory a pravostrannému srdečnímu selhávání. K těmto nežádoucím důsledkům dochází při vzestupu hematokritu nad 0,60. U příjemců transplantovaných ledvin je cytoredukční erytrocytaferéza indikována jen jako přechodná paliativní léčba v případě subjektivních potíží pacienta.
Snížení počtu erytrocytů a tím i hodnoty hematokritu lze dosáhnout jednoduchou a finančně minimálně náročnou flebotomií.
Zde jsme však omezeni maximálním možným objemem odebrané krve 400-500ml. Nevýhodou je nutnost opakovaných venepunkcí při potřebě větší redukce hematokritu, devastace periferního žilního systému, nežádoucí ztráta plazmatických bílkovin, koagulačních faktorů a trombocytů a riziko vasovagální reakce při odběru. V případě vzniku hyperviskozního syndromu není klasická flebotomie schopna zajistit rychlou redukci hematokritu
Druhou možností jak zajistit redukci počtu erytrocytů je cytodepleční erytrocytaferéza s použitím kontinuálních nebo diskontinuálních separátorů krevních elementů. Tento léčebný výkon umožní rychlou normalizaci rheologických poměrů v cévním řečišti odběrem i velkého množství ( > 1000 ml) erytrocytů) během jedné procedury. Důsledně izovolemickým průběhem je eliminováno nebezpečí vzniku vasovagální reakce i u rizikových pacientů. Počet nutných venepunkcí je minimální a nedochází ke ztrátám plazmatických bílkovin. Nevýhodou je finančně náročné přístrojové vybavení i cena separačních setů. V případě odběru objemu erytrocytů většího než 700ml je doporučováno doplnění substitučního roztoku koloidním roztokem (5% albumin).
V letech 1995 - 2000 provedlo aferetické pracoviště Krevního centra FNsP Ostrava 208 léčebných cytoredukčních erytrocytaferéz u 98 pacientů. Indikacemi byly polycytemia vera, sekundární polyglobulie při chronických plicních onemocněních, vrozených srdečních vadách s pravolevým zkratem, tumorech ledvin, polyglobulie nejasné etiologie, polyglobulie po transplantaci ledviny, hemochromatóza a recidivující trombózy dolních končetin při trombofilním stavu. Výkony byly prováděny vždy na kontinuálním separátoru krevních elementů COBE-Spectra ze dvou periferních žilních přístupů. Nesrážlivost krve byla zajištěna citrátovým roztokem ACD-A. Odebrané množství erytrocytů bylo v rozmezí 400 - 1500ml.
Pouze u jednoho pacienta jsme zaznamenali vasovagální rekci s hypotenzí v průběhu odběru. U dvou pacientů bylo nutno opakovat venepunkci pro nedostatečný průtok krve přístrojem při insuficienci povrchových žil horních končetin.
Projevy citrátové reakce nebyly zaznamenány, i když preventivní parenterální aplikace kalcia nebyla používána. Spotřeba citrátového roztoku na jeden výkon byla v rozmezí 56 - 177 ml. Největší počet nemocných byl indikován k erytrocytaferéze pro polyglobulii při plicním onemocnění, nejvyšší hodnoty hematokritu pro které byl aferetický výkon indikován byly u pacientů s cyanotickými srdečními vadami (až 0,75). Trvání výkonu se pohybovalo v rozmezí 15 - 35 minut.
Ve skupině pacientů s plicním onemocněním je nutno pečlivě vážit cílovou hodnotu hematokritu, přínos i rizika výkonu. Medián výchozí hodnoty hematokritu byl 0,57, medián cílové hodnoty 0,44. Ve srovnání s obdobnou prací Pollariho byly tyto hodnoty velmi blízko (0,57 resp. 0,44). U transplantovaných pacientů byl medián výchozí hodnoty hematokritu 0,58. Např. práce Sumraniho indikuje erytrocytaferézu při hematokritu 0,54 - 0,64.
Hematokrit u pacientů s polycytemia vera měl medián 0,60. Jako vysoce rizikové pro vznik tromboembolických komplikací jsou uváděny hodnoty vyšší než 0,55 - 0,60. Pacientům se srdeční vadou byl výkon indikován kardiologickými pracovišti při hodnotách hematokritu 0,52-0,75. Rozdílnost indikačního přístupu a s tím i rozdílnost vstupních a cílových hodnot hematokritu je zde nejvíce patrná.
Mezi indikace nesouvisející s polyglobulií jsme zařadili pacienta s recidivujícími tromboflebitidami dolních končetin při deficitu proteinu C. Zde byla erytrocytaferéza prováděna jako hemodiluce s dobrým léčebným efektem. Dvakrát jsme prováděli erytrocytaferézy u pacientů s hemochromatózou ( hodnoty ferritinu 1500 - 2900ng/ml).
Cytoredukční erytrocytaferéza je podle našich zkušeností výkonem bezpečným s minimálním výskytem komplikací, podmínkou je odpovídající periferní žilní přístup. Nevýhodou je nutnost finančně náročného přístrojového vybavení. U pacientů léčených opakovaně a dlouhodobě erytrocytaferézami je popsán pokles nutných rehospitalizací ( o 50 - 65%) a tím v konečném součtu snížení nákladů na léčbu.

RIZIKO CITRÁTOVÉ INTOXIKACE PŘI LÉČEBNÝCH AFERÉZÁCH

Základní předpoklad léčebného aferetického výkonu používajího separátoru krevních částic pracujícího jak na principu centrifugace, tak filtrace, je zajištění nesrážlivé krve v mimotělním oběhu krve. Pro zajištění nesrážlivé krve je možno použít roztoky citrátu sodného, heparin nebo kombinaci obou uvedených přípravků. V běžné praxi aferetického střediska je používán nejčastěji roztok ACD-A. Princip účinku je založen na tvorbě komplexu kalcium-citrát, tím vyvázání ionizovaného kalcia, které se pak nemůže uplatnit v koagulační kaskádě. Komplex kalcium-citrát je odbouráván v játrech a koagulace v cirkulaci nemocného zůstává intaktní.
Použití roztoku citrátu sodného může být příčinou jedné z nejčastěji popisovaných komplikací aferetického léčebného výkonu - citrátové hypokalcémie. Klinické příznaky jsou závislé na míře poklesu hladiny ionizovaného kalcia. Mohou být mírné (cirkumorální parestezie, brnění prstů rukou), středně závažné (křeče prstů na nohou) až těžkého stupně (nausea, zvracení, srdeční arytmie).
Riziko vzniku citrátové hypokalcémie je závislé na několika faktorech:
a) poměr mísení krve s citrátem při léčebném výkonu Riziko narůstá s menším poměr krev:citrát.
b) objem citrátového roztoku spotřebovaného při výkonu Čím větší objem roztoku ACD-A použitého při aferéze, tím větší riziko
c) rychlost průtoku krve separátorem během výkonu Vznik rizika citrátové reakce je přímo úměrný rychlosti průtoku krve separátorem

Pravděpodobnost vzniku citrátové hypokalcémie je u jednotlivých léčebných aferetických výkonů různé. Nejmenší je u léčebné erytrocytaferézy, kde je spotřeba citrátového roztoku při jednom výkonu malá, 50 - 150 ml podle odebraného objemu erytrocytů a mísící poměr krev:citrát je 13:1. Vyšší míra rizika je u léčebné výměnné plazmaferézy, kdy je spotřeba citrátového roztoku při výměně jednoho plazmatického objemu 450 - 800 ml podle hmotnosti, výšky a hematokritu pacienta a poměr krev:citrát 12:1. Část citrátového roztoku je v průběhu výkonu odstraněna současně s odebranou plazmou. Nejvyšší riziko vzniku citrátové intoxikace je při léčebných cytoredukčních leukocytaferézách, trombocytaferézách, odběrech periferních kmenových buněk a imunoadsorbčních výkonech. Objem odebraných buněk při léčebných cytaferézách je pouze několik stovek mililitrů a převážná část citrátového roztoku je infundována zpět do oběhu pacienta.
Jako bezpečné množství citrátu sodného je udáváno 0,8 - 1,0 ml/min/litr objemu krve pacienta. Jako velké množství citrátu je popisován průtok větší než 1,0ml/min./1itr objemu krve. Moderní separátory umožňují toto množství předem nastavit tak, aby nedošlo k překročení bezpečné hranice. Vzniku hypokalcémie lze zabránit preventivním opatřením - podáním ionizovaného kalcia. Někteří autoři požívají substituci kalcia až při projevech citrátové intoxikace. Hladinu ionizovaného kalcia je možno v průběhu aferetického výkonu monitorovat a léčebně uasáhnout při jejím poklesu. Nejjednodušší metodou prevence vzniku citrátové hypokalcémie je vypití 2 dl mléka před výkonem. Další možností je podání perorálního preparátu kalcia před nebo během výkonu. Nevýhodou je nestandardní nebo nedostatečné vstřebávání ionizovaného kalcia ze zažívacího traktu. Nejspolehlivější je parenterální aplikace přípravku kalcia, nejlépe kontinuálně pomocí infuzní pumpy během celé délky trvání aferetického výkonu.
Mezi preventivní opatření lze zahrnout i požití kombinace citrátového roztoku a heparinu při odběrech periferních kmenových buněk nebo imunoadsorbci a tím redukci potřebného objemu citrátového roztoku.
Dojde-li k rozvoji klinických příznaků hypokalcémie, je prvním opatřením snížení průtoku krve separátorem na únosné minimum a tím snížení zátěže pacienta citrátem. Neprojeví-li se účinek během několika minut, je nutno podal ionizované kalcium parenterálně jako bolus.

Pro parenterální aplikaci jsou k dispozici dva preparáty kalcia:
Calcium glukonicum 1 amp. = 10ml = 90,18mg Ca++
Calcium chloratum 1 amp. = 10ml = 182,76mg Ca++

Pro náhradu ionizovaného kalcia vyvázaného 1ml roztoku ACD-A je nutno podat 0,5mg Ca++.

Kalcium chlorid je hyperosmolání, 1600 mOsm, musí se aplikovat ředěný albuminem nebo fyziologickým roztokem v infuzi.
Kalcium glukonát můžeme aplikovat pomalu přímo intravenózně do navratu separačního setu.Opatrnosti je třeba v případě léčebné výměnné plazmaferézy, používáme-li jako náhradní roztok čerstvou zmraženou plazmu pro riziko rekalcifikace plazmy
Aplikujeme-li substitučné dávku ionizovaného kalcia v 5% roztoku albuminu, je nutno podat dávku dvojnásobně vysokou (1mg Ca++/ 1ml roztoku ACD-A . Albumin váže 50% podaného ionizovaného kalcia.

VAZBA TROMBINU NA FIBRINOGEN MODIFIKOVANÝ MALONDIALDEHYDEM

Oxidační stres je spojen s patogenezí řady lidských nemocí. Fibrinogen, který hraje klíčovou roli v hemostáze, snadno podléhá oxidačnímu působení oxidantů nacházejících se v krvi při oxidačním stresu. Oxidovaný fibrinogen vykazuje odlišné chování od neoxidovaného fibrinogenu. Studie s různými oxidačními systémy ukazují, že modifikace fibrinogenu vede k redukci tvorby fibrinového klotu indukované trombinem. Protože uvolňování fibrinpeptidů trombinem je ovlivněno (sníženo) jen málo, zdá se že inhibice tvorby fibrinového klotu je způsobena vlivem na polymeraci fibrinových monomerů.
Malondialdehyd (MDA) je jedním z produktů lipoperoxidace a snadno reaguje s aminoskupinami proteinů. Při sledování vazby trombinu na fibrinogen jsme zjistili, že malé množství aktivního trombinu se váže na imobilizovaný fibrinogen ireversibilně. Po opakovaném promytí zůstává na 1 mol fibrinogenu navázáno 0,05 mol trombinu. Přirozeně se vyskytující varianta fibrinogenu, zastoupena u každého normálního jedince 5-10 %, váže trombin s vysokou afinitou. Aktivita trombinu vázaného na imobilizovaný fibrinogen byla sledována spektrofotometricky pomocí specifického substrátu pro trombin. Za fysiologických podmínek volné aldehydové a karbonylové skupiny vytvořené působením malondialdehydu mohou reagovat s volnými aminoskupinami v krvi. Proto byly karbonylové skupiny fibrinogenu po modifikaci jednak blokovány etanolaminem nebo byly ponechány volné. Vazba trombinu na modifikovaný fibrinogen s volnými i se zablokovanými reaktivními skupinami byla vyšší než na nemodifikovaný fibrinogen. Adheze krevních destiček (za statických podmínek) na modifikovaný fibrinogen byla také ovlivněna a byla nižší než na nemodifikovaný fibrinogen.

Poděkování: tato práce vznikla díky grantům IGA MZd ČR NK-6841 a GAČR 102/99/0549.

PŘÍSPĚVEK NÍZKOMOLEKULÁRNÍCH ANTIOXIDANTŮ K CELKOVÉ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITĚ KREVNÍ PLAZMY

Oxidační stres (nadprodukce reaktivních kyslíkatých látek - volných radikálů) je v posledních letech velmi sledovaným fenoménem zvláště díky jeho vztahu k různým závažným onemocněním a patologickým procesům, jako jsou infarkt myokardu, nádorové bujení, poruchy imunitního systému či ateroskleróza. Ty jsou výsledkem negativního oxidačního působení volných radikálů na bílkoviny, lipidy a nukleové kyseliny.
Organismus se účinku volných radikálů brání přítomností některých enzymů (glutathion peroxidasa, katalasa a další) a přítomností sloučenin schopných zhášet volné radikály (antioxidanty). Nejúčinnějšími a také nejznámějšími antioxidanty jsou vysokomolekulární albumin a nízkomolekulární vitaminy E a C, redukovaný glutathion a kyselina močová. Pro stanovení těchto nízkomolekulárních antioxidantů v plazmě a biologických vzorcích existuje řada různých metod. Vypracovali jsme metody pro souběžné stanovení vitaminů A a E, vitaminu C a kyseliny močové, glutathionu a homocysteinu v lidské krevní plazmě využívající ion-párovou vysoce-účinnou kapalinovou chromatografii na reverzní fázi a upravili je pro detektor Coulochem II využívající značně citlivé elektrochemické detekce. Antioxidační účinky nízkomolekulárních antioxidantů lze dobře dokumentovat korelací zjištěných koncentrací těchto látek s výsledky souběžného stanovení celkové antioxidační kapacity krevní plazmy, která vypovídá o celkové schopnosti plazmy bránit se působení volných radikálů. Pro tato stanovení vznikla v posledních letech řada metod často využívajících umělé přesně definované produkce volných radikálů v měřeném vzorku a používajících ke kalibraci stabilní analog vitaminu E Trolox. Adaptovali jsme dvě z nich 1) založenou na měření absorbance kladně nabitého radikálu 2,2´?azinobis-(ethylenbenzothiazolin-6-sulfonové kyseliny), který vzniká v přítomnosti peroxidu vodíku a metmyoglobinu a je zhášen ve vzorku přítomnými antioxidanty a 2) založenou na antioxidanty inhibovaném blednutí oranžového karotenoidu krocinu. Toto blednutí je způsobeno peroxylovými radikály generovanými termálním rozkladem 2,2'-azobis-(2-amidinopropanu). Obě metody jsme upravili pro měření vzorků v 96-ti jamkových mikrotitračních destičkách.
Námi získané výsledky ukazují na významný vliv nízkomolekulárních antioxidantů, obzvlášť kyseliny močové, na celkovou antioxidační kapacitu vzorků lidské krevní plazmy. Uvedené metody nám umožnily hledat souvislosti mezi aktivací krevních destiček kolagenem, jehož působením vznikají v destičkách reaktivní kyslíkové látky, a různými koncentracemi antioxidantů v krevní plazmě. Mezi koncentracemi antioxidantů (kyselina močová, glutathion) přítomných v plazmě a celkovou antioxidační kapacitou plazmy, jsme nalezli významné korelace, zejména v případě jejího stanovení měřením lag-fáze při produkci zeleného kation radikálu ABTS. Naopak vzájemná korelace obou metod stanovení celkové antioxidační kapacity je slabá a to díky odlišným principům stanovení a zhášení různých volných radikálů.

Poděkování: Tato práce vznikla díky podpoře grantu IGA MZd ČR NK-6841

KOMPLEXNÍ STANOVENÍ TROMBOFILNÍCH MUTACÍ PCR TECHNIKOU

Předmětem našeho krátkého sdělení je nová metoda určená pro detekci trombofilních mutací. Pro stanovení základních trombofilních mutací t.j. Faktor V Leiden r/Q 506, Faktor II:20210 G/A a MTHFR. A/V 223 využívá stanovení multiplex PCR techniky.
Metoda je postavena na základě "multiplex" PCR reakce, která kombinuje více primerů v jediné reakci. V tomto stanovení je 6 specifických kombinací primerů pro amplifikaci mutantní stejně jako zdravé allely tří rozdílných genů. Takto mohou být homozygotní i heterozygotní nosiči všech tří mutací identifikováni pomocí jediného PCR testu. Produkty reakce jsou následně podrobeny elektroforéze na speciálním gelu s vysokou rozlišovací schopností.
Tato metoda jako první přibližuje PCR diagnostiku trombofilních mutací přímo rutinním specializovaným koagulačním pracovištím. Nespornou výhodou tohoto stanovení je relativní jednoduchost, rychlost a komplexnost.
Komplexnost stanovení je důležitá, jelikož homozygotní jedinci s mutací ve faktoru V a protrombinovém genu, stejně jako kombinované heterozygotní defekty představují vyšší trombotické riziko než pouze individuální heterozygotní defekty.

STANOVENÍ D-DIMERŮ METODAMI LIA TEST D-DIMER A VIDAS D-DIMER

Měli jsme možnost porovnat metodu stanovení D-dimerů Liatest D-Di od firmy Diagnostica Stago s metodou VIDAS D-Dimer firmy bioMérieux.
Liatest D-Di (Diagnostica Stago, Asnieres, Francie) je plně automatizovaná kvantitativní imunoturbidimetrická metoda stanovení D-dimerů na přístroji STA Compact. Paprsek monochromatického světla se střetne se suspenzí mikrolatexových částic potažených dvěma různými myšími monoklonálními protilátkami proti lidským D-dimerům. Jestliže je vlnová délka světla větší než průměr latexových částic (není přítomen antigen), dochází pouze ke slabé absorpci. V přítomnosti antigenu dochází ke vzniku agregátů větších než vlnová délka procházejícího světla. Tím dochází i k vyšší absorpci světla, která je úměrná hladině antigenu ve vzorku. Monitoruje se kinetika reakce (sleduje se změna absorbance při 540 nm po 140 sekundách). První výsledek je vydán po 7 minutách, další následují po minutě.
VIDAS D-Dimer (bioMérieux, Marcy l`Etoile, Francie) je kvantitativní plně automatizovaná Rapid ELISA metoda stanovení D-dimerů s fluorescenční detekcí na přístroji VIDAS imunoanalyzer. Na pevné fázi ve speciální špičce je zakotvena specifická protilátka proti D-dimerům MAb 10B5E12C9, tato špička zároveň slouží k pipetování vzorku plazmy a konjugátu. Jako konjugát slouží alkalická fosfatáza značená protilátkou proti lidským D-dimerům MAb 2C5A10. Po odměření příslušného množství plazmy do první jamky ve stripu jsou všechny další kroky (imobilizace antigenu, imobilizace konjugátu, inkubace, detekce, výpočet) řízeny přístrojem. Výsledky (až 12 současně) jsou vydány po 35 minutách. Je-li koncentrace D-dimerů vyšší než 1 mg/l, je nutné plazmu naředit a vyšetření zopakovat.
V této srovnávací studii bylo zpracováno 50 vzorků plazem pacientů hospitalizova-ných ve FN Hradec Králové pro různé diagnózy (22 žen, věk 26 - 70 let a 28 mužů, věk 18 - 76 let). Koncentrace D-dimerů se pohybovala od normálních hodnot (< 0,5 mg/l) až po hodnoty vysoké ( > 10 mg/l).
Plazmatické hladiny D-dimerů z jednotlivých měření spolu vzájemně korelují (r = 0,97). Zjistili jsme, že koncentrace D-dimerů v plazmě naměřené Liatestem D-Di jsou srovnatelné s hodnotami získanými od VIDAS D-Dimer.

Měření nízkého počtu trombocytů, erytrocytů a leukocytů na hematologických analyzátorech ADVIA 120 firmy BAYER a CELL DYN 3200 firmy ABBOTT. Využití analyzátorů ke sledování kvality plasmy v transfúzní službě.

Souhrn:
V transfúzní službě se klade důraz na kvalitu výstupních produktů. Jedním z produktů je plasma z plné krve nebo aferézy. Mezi kontrolované parametry těchto produktů patří i počty trombocytů, erytrocytů a leukocytů, které se zpravidla stanovují mikroskopický. Dají se pro stanovení zbytkových buněk v plasmě využít i hematologické analyzátory, které se vyznačují značnou přesností a správností měření? Jsou tyto analyzátory dostatečně citlivé pro měření nízkých počtů trombocytů, erytrocytů a leukocytů v plasmě? Otázku musíme rozdělit na dvě dílčí. Jednu týkající se měření trombocytů a druhou týkající se erytrocytů a leukocytů.
Norma pro počet trombocytů v plasmě je k dnešnímu dni do 50. 109 l-1. Je všeobecně známo, že takové počty analyzátory lehce zvládají. Zbývá určit limitní hodnotu počtu trombocytů, u které lze předpokládat, že skutečný počet trombocytů ve vaku s plasmou není s dostatečnou pravděpodobností vyšší než daná norma. Se započítáním nejdůležitějších vlivů byla tato limitní hodnota na našem oddělení stanovena na 37.109 l-1 trombocytů v plasmě.
Otázka počítání zbytkových buněk v plasmě - erytrocytů a leukocytů se zdá být jednodušeji zodpověditelná. Povolené pozadí u obou analyzátorů u počítání leukocytů je do 0,1 . 109 l-1, tj. stejná hodnota jako je norma pro počet leukocytů v plasmě. U erytrocytů je hodnota povoleného pozadí (0,02. 1012 l-1) daleko vyšší než norma pro počet erytrocytů v plasmě (0,006. 1012 l-1). Z uvedených dat je zřejmé, že sledování nízkého počtu trombocytů v plasmě pomocí daných hematologických analyzátorů má smysl, počítání leukocytů a erytrocytů zřejmě nikoli.

FEMOROPOPLITEÁLNÍ TROMBÓZA U ADOLESCENTNÍ DÍVKY S APS A DEFEKTEM F.XII JAKO PRVNÍ PŘÍZNAK KOLAGENÓZY

Třináctiletá dívka k nám byla předána z cévní chirurgie po provedení bypassového výkonu s již zavedenou POAK léčbou . Vzhledem k věku dívky jsme předpokládali ,že důvodem trombózy je trombofilní diatéza ..Postupně byl prokázán antifosfolipidový syndrom a mírný familiární deficit Hagemanova faktoru. Na počátku chyběly jiné klinické a laboratorní příznaky, odpovídající kolagenóze a bylo vyloučeno postižení ledvin . Až v průběhu několika roků se manifestoval sérologický nález , odpovídající SLE ,objevil se zvýšený odpad bílkovin v moči a následně se prokázala biopticky lupusová nefritida. Mezitím dívka dosáhla dospělosti a byla předána na revmatologické, nefrologické a hematologické oddělení pro dospělé.

VYŠETŘENÍ APC-REZISTENCE

Rezistence na aktivovaný protein C (APC-R) je snížená antikoagulační odpověď na aktivovaný protein C (Dahlback a spol. 1993). Příčinou tohoto fenotypického nálezu je ve většině případů Leidenská mutace faktoru V (FVL), která patří v naší populaci k nejčastějším hereditárním trombofíliím.
Ostatní genetické příčiny APC-R jsou stále předmětem výzkumu. K příčinám získané APC-R patří zvýšení F VIII, přítomnost lupus antikoagulans (LA), těhotenství, hormonální substituce, hormonální antikoncepce, antikoagulační léčba, významné defekty proteinu C a S a také nesprávné zpracování vyšetřované plazmy.
K diagnostice APC-R se používají koagulační metody testující antikoagulační odpověď plazmy na zevně dodaný aktivovaný protein C (APC). Většina metod je založena na principu aPTT a výpočtu poměru časů APTT s přídavkem APC a APTT bez APC.
Na odlišném principu je postaven nový diagnostický set STA - Staclot APC-R firmy Diagnostica Stago. Test využívá hadí jed Crotalus viridis Helleri, který je přímým specifickým aktivátorem faktoru X. Měří se koagulační čas vyšetřované plazmy po přidání reagens. Detekce APC-R je pak založena na porovnání tohoto s definovanou hodnotou (cut-off) v sekundách.
K testovacímu systému je přidáván APC a F V deficitní plazma. Touto plazmou se do vyšetřované směsi dodává kontrolované množství proteinu S a faktoru VIII, čímž se spolu s přímou aktivací FX podstatně zvyšuje specifita testu. Obohacení fosfolipidy omezuje interferenci LA. Test je tedy spolehlivý i u pacientů s abnormálním hladinami proteinu S a C. Vyšetření není ovlivněno antikoagulační terapií jak kumariny (použití FV deficitní plazmy), ani heparinem (UFH i LMWH) díky přítomnosti inhibitoru heparinu (do 1 IU/ml).
Všechny reagencie včetně kontrol v normálním i patologickém rozsahu jsou součástí setu. Zpracování plazmy je stejné jako na běžná koagulační vyšetření. Metoda je jednoduchá na provedení, může být plně automatizována a dosahuje výborné shody s molekulárně diagnostickými technikami detekce FV Leiden, zatímco ostatními defekty není ovlivněná.
V naší práci prezentujeme výsledky skupiny pacientů s nejednoznačnými výsledky koagulační metody APC-R na principu aPTT nebo testu ProC Global a genetického vyšetření FVL. Uspořádání testu dle našich výsledků i dle literárních údajů poskytuje prakticky 100% senzitivitu i specifitu metody pro FVL.

TROMBOTICKÁ TROMBOCYTOPENICKÁ PURPURA (TTP) U PACIENTA S KARCINOMEM ŽALUDKU (POPIS PŘÍPADU)

Sekundární formy TTP jsou popisovány v průběhu těhotenství, ve vztahu k některým lékům, u pacientů s AIDS a také u maligních nádorů.
Prezentujeme případ 55-letého muže s osmi-týdenní anamnézou vertebrogenního algického syndromu (při diskopatii úseku L4-S1) a s krvácejícím žaludečním vředem, který vznikl po užívání nesteroidních antirevmatik.
Důvodem přijetí na OKH FNHK byla progredující normocytární anémie a závažná trombocyto-penie (24 x 109/L). Laboratorní vyšetření prokázala mikroangiopatickou hemolytickou anémii a potvrdila závažnou trombocytopenii. V koagulačním vyšetření byla zvýšena hodnota D-dimerů. Ostatní nálezy byly v mezích fyziologické normy. Později se objevily neurologické poruchy charakterizované přechodnými poruchami orientace. Byla zahájena výměnná plazmaferéza (2 - 4 litry/d.). Dále byl podán Solu-Medrol v dávce 125mg/d a Vincristin 1mg/ týdně. Červená řada musela být korigována opakovanými erytrocytárními převody. V úvodu terapie dochází k přechodnému vzestupu krevních destiček (24…59 x 109/L) a ke snížení hodnoty LDH a bilirubinu. Později však známky hemolýzy a trombocytopenie progredují i přes opakované plazmaferézy a výše uvedenou terapii.
Neúspěšný postup vedl k revizi předchozích vyšetření. Pomocí NMR byl zjištěn metastatický rozsev tumoru v L páteři. Bioptické vyšetření z okraje žaludečního vředu pak prokázalo adenokarcinom žaludku. Rychlá progrese a celkový stav nemocného neumožnily chirurgickou a cytostatickou terapii. Pacient zemřel pod obrazem hemorrhagické diatézy.

VRODENÝ DEFEKT FAKTORA VII - KLINICKÄ SYMPTOMATOLÓGIA (V NAŠOM MATERIÁLI)

Pribúdajú zprávy o róznej miere korelácie medzi mierou defektu FVII a jeho klinickou symptomatológiou, hlavne v skupine ťažkých defektov.
Autori hodnotia súbor 40 paientov s defektom FVII. Skupina 32 pacientov v 18 rodinách má ľahký defekt FVII 23-66% (priemer 45%). U 5 zistený aj iný, klinicky nevýznamný defekt hemostázy (defekt FXII, FXI, FX). Defekt FVII v tejto skupine považujú za asymptomatický a jeho nález při miernej a príležitostnej krvácavej symptomatológii za náhodnú koincidenciu s inou príčinou. Skupinu s ťažkýchm defektom tvorí 8 pacientov v 7 rodinách s aktivitou FVII 0,6-1,7% (priemer 1,1%). Šesť pacientov v tejto skupine má výraznú krvácavú symptomatológiu. Dvaja pacienti sú téměř asymptomatickí. U týchto 2 pacientov chýba korelácia medzi mierou defektu a klinickou symptomatológiou.
Ako možné vysvetlenie asymptomatickosti ťažkého defektu FVII u jedného pacienta zistili rezistenciu na aktivovaný protein C a u druhého tiež predpokladajú spoluúčasť vrodenej trombofilie.
Jednou z možných príčin róznej korelácie medzi mierou defektu FVII a klinickou symptomatológiou móže byť aj spoluúčasť iných získaných a vrodených defektov hemostázy.

VYUŽITÍ NOVÉHO ANALYZÁTORU POUŽÍVANÉHO KE SLEDOVÁNÍ FUNKCE KREVNÍCH DESTIČEK (PFA-100TM) V KLINICKÉ PRAXI

Krevní destičky hrají klíčovou úlohu v procesech krevního srážení, zejména v primární hemostáze. Byly vyvinuty testy popisující fyziologické procesy uplatňující se ve fázi adheze, aktivace a agregace krevních destiček v případě poranění stěny krevních kapilár.
PFA-100TM (Platelet Function Analyzer, Dade Behring) je systém simulující in vitro primární hemostatické mechanismy, test umožňuje rychlé testování funkce trombocytů za použití malého množství citrátové krve. Princip stanovení pomocí tohoto přístroje popsal Kratzer a Born (1985) - kapilárou je krev nasávána směrem k membráně s aperturou uprostřed, membrána je potažena subendoteliálním proteinem kolagenem v kombinaci s adrenalinem (C/EPI) či ADP (C/ADP), působením stimulátorů se aktivují trombocyty a po určité době dochází k vytvoření primární hemostatické zátky. V modifikovaném systému je sledován průtok krve, od prvního kontaktu s membránou až po okamžik, kdy dojde k uzavření otvoru v membráně. Hodnota CT (closure time), vyjádřená v sekundách, je indikátorem funkce trombocytů.

V naší studii jsme stanovili normální referenční meze pro oba typy použitých měřících modulů. Použili jsme průměr ± 2SD. Pro C/EPI se tyto hodnoty pohybují v rozmezí 82-160 s při průměrné hodnotě 121 ± 19,5 s, pro C/ADP je rozmezí 62-104 s a průměrná hodnota 83 ± 10,5 s. Přístrojem PFA-100 jsme vyšetřili 26 krevních vzorků od nemocných s poruchami hemostázy z Oddělení klinické hematologie FN HK. Do studie byli zahrnuti jak muži, tak i ženy, ve věku 17 - 75 let, s různými diagnózami. Hodnoty "CT" se pohybovaly v rozmezí 70 - 300 s pro C/EPI, 60-300 s pro C/ADP. Byla zjištěna statisticky významná korelace testu PFA-100 s vyšetřením krvácivosti technikou Simplate, dále hladinou antigenu von Willebrandova faktoru, FVIIIRCoF (ristocetinového kofaktoru) a s ristocetinem indukovanou agregací krevních destiček. Stanovení funkce krevní destičky pomocí přístroje PFA-100 se ukazuje jako vhodná metoda především k doplnění diagnostiky von Willebrandovy nemoci.