Molekulární patologie

(doc. MUDr. Jan Laco, Ph.D.)

Příprava knihovny pro masivně paralelní sekvenování

Laboratorní tým molekulární patologie

Bioinformatické zpracování dat z masivně paralelního sekvenování

Hlavní činností laboratoře molekulární patologie na Fingerlandově ústavu patologie je vyšetřování prognostických a prediktivních markerů u nádorových onemocnění. Rutinně využíváme metody molekulární biologie, zejména PCR v různých modifikacích, multiparalelní sekvenování (NGS) a in situ hybridizaci (fluorescenční (FISH), chromogenní (CISH) a se stříbrem (SISH)).

Vyšetření provádíme převážně z parafínových bloků tkání (tkáně fixované 10% roztokem neutralizovaného pufrovaného formalínu a zalité do parafínu - FFPE), pro metody založené na principu PCR a NGS také z tkání nativních a z cytologických nátěrů. Pro analýzu cirkulující nádorové DNA je použita nesrážlivá krev nebo zmražená plasma.

Výsledky všech molekulárních vyšetření jsou dostupné do 14 dnů od příjmu do laboratoře (ve výjimečných případech do 1 měsíce).

Typizaci lidských papilomavirů (HPV) provádíme jak z FFPE (zejména u nádorů anogenitální oblasti a oblasti hlavy a krku), tak z gynekologických cytologií (stěry z děložního čípku). Výsledky vyšetření poskytujeme obvykle do 10 pracovních dnů.

Naše pracoviště slouží jako referenční laboratoř pro vyšetřování prediktivních markerů u nádorových onemocnění.

Naše laboratoř se dlouhodobě a úspěšně účastní následujících systémů externího hodnocení kvality:

a) UK NEQAS Breast HER2 ISH (amplifikace genu HER2)

b) ESP Colon EQA Scheme (mutace genů KRAS, NRAS a BRAF)

c) ESP Lung EQA Scheme (mutace genu EGFR, přestavba genu ALK)

d) SZÚ - Program EHK: PT#M/31 (detekce papillomavirů)

e) EMQN Molecular testing of BRCA genes in Ovarian Cancer - vSomatic (mutace genů BRCA1 a BRCA2)

Laboratoř molekulární patologie:		495 832 376, 495 833 237
Vedoucí laboratoře:	doc. MUDr. Jan Laco, Ph.D.	495 832 548
VŠ pracovníci:	RNDr. Hana Vošmiková	495 832 381
	RNDr. Kateřina Sieglová	495 832 112

Přehled rutinně prováděných vyšetření

Gen	Genetická změna	Vyšetřovací metoda	Obvyklá indikace
chromozomy 1p a 19q	delece	FISH	nádory centrálního nervového systému
ALK	přestavba	FISH	karcinom plic
BRAF	bodové mutace	PCR, NGS	maligní melanom, karcinom tlustého střeva
EBER (EBV)	přítomnost infekce	CISH	hematologické malignity, infekce EBV
EGFR	bodové mutace/delece/inzerce	Real-time PCR, NGS	karcinom plic
HER2	amplifikace	SISH/CISH	karcinom prsu, karcinom žaludku a/nebo gastroezofageální junkce
HPV	přítomnost infekce, typizace	Real-time PCR	benigní a maligní nádory a prekancerózní léze anogenitální krajiny a oblasti hlavy a krku
KRAS	bodové mutace	Real-time PCR, NGS	karcinom tlustého střeva
NRAS	bodové mutace	Real-time PCR, NGS	karcinom tlustého střeva, maligní melanom

Postup pro žadatele o molekulárně patologické vyšetření

1. Vyplnit „Žádanku o běžné histologické/cytologické vyšetření“. - ke stažení zde

2. Do položky „Předmět vyšetření … “ napsat požadované molekulárně patologické vyšetření, včetně
imunohistochemických (např. exprese hormonálních receptorů, exprese HER2, apod.).:

Amplifikace genu HER2 (HER2 ISH)
Přítomnost EBV
Delece chromozómů 1p a 19q
Přestavba genu ALK
Mutace genu KRAS
Mutace genu NRAS
Mutace genu EGFR
Mutace genu BRAF
Přítomnost HPV

!!!!!!Pokud je vzorek zasílán na Fingerlandův ústav patologie v rámci konzultačního vyšetření z jiného pracoviště je pak ještě třeba k vyplněné žádance přiložit:

3. výsledkový protokol původního bioptického/cytologického vyšetření.

4. parafínový tkáňový bloček s dostatečným množstvím nádorové tkáně. U případů s malým množstvím nádorové tkáně, zejména u karcinomu plic, je velmi vhodné zaslat také původní preparát barvený hematoxylinem-eozinem, případně cytologický nátěr.

Postup pro žadatele o vyšetření mutací v genu EGFR z krve - "tekutá biopsie"

1. Obrátit se telefonicky na laboratoř molekulární patologie (495 832 376), která zajistí dodání speciálních odběrových zkumavek určených pro vyšetření ctDNA.

2. Při odběru krve se řídit pokyny zaslanými spolu s odběrovou zkumavkou - ke stažení zde. Vyplnit "Žádanku o běžné histologické/cytologické vyšetření".

3. Zajistit šetrný transport krve a žádanky do laboratoře molekulární patologie.

Postup pro žadatele o vyšetření přítomnosti HPV DNA v gynekologické cytologii

1. Vyplnit „Žádanku na test přítomnosti HPV DNA“. - ke stažení zde

2. Odebrat vzorek pomocí odběrové soupravy, která je spolu s transportní nádobkou k dispozici na vyžádání v laboratoři gynekologické cytologie FÚP (tel.: 495 832 570) a jejíž dodání je zajišťováno pomocí pravidelného svozu. Do transportní nádobky vložit pouze bílý konec odběrové soupravy.

3. Vyplněnou žádanku spolu s označenou transportní nádobkou odeslat svozem do FÚP.

Nerutinně prováděná vyšetření

Kromě výše uvedených rutinně prováděných metod nabízíme po domluvě provedení dalších vyšetření:

Gen	Genetická změna	Vyšetřovací metoda	Obvyklá indikace
BCL2	zlom	FISH	hematologické malignity
BCL6	zlom	FISH	hematologické malignity
BRCA1	bodové mutace/delece/inzerce	NGS	karcinom vaječníku
BRCA2	bodové mutace/delece/inzerce	NGS	karcinom vaječníku
CCND1 (cyklin D1)	translokace	FISH	hematologické malignity
C-MYC	zlom	FISH	hematologické malignity
HPV 6 a 11	průkaz přítomnosti	ISH	papilomatózy
NUTM1/NUT	translokace	FISH	maligní nádory sinonazálního traktu, mediastina apod.
RET	bodové mutace/ delece/inzerce	NGS	karcinom štítné žlázy
SMARCB1/INI1	delece	FISH	maligní nádory sinonazálního traktu, nádory centrálního nervového systému, nádory měkkých tkání

# vyšetření prováděno v rámci flexibilního rozsahu akreditace

Pro výzkumné účely provádíme analýzu mutačního stavu dalších genů pomocí sekvenování nové generace. Seznam genů aktuálně zařazených v sekvenačních panelu:

AKT1	FGFR2	MSH6
ALK	FOXL2	NOTCH1
APC	GNA11	NRAS
ARID1A	GNAQ	PDGFRA
BRAF	GNAS	PIK3CA
BRCA1	HRAS	PMS2
BRCA2	IDH1	PTEN
CDH1	IDH2	SMARCA4
CDKN2A	KIT	SMARCB1
CTNNB1	KRAS	SMAD4
EGFR	MAP2K1	SRC
EPHB2	MDM2	STK11
ERBB2	MET	TP53
ESR1	MLH1
FBXW7	MSH2